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TRIzol法提取總RNA的實(shí)驗(yàn)原理

更新時(shí)間:2022-03-23瀏覽:3223次

   說(shuō)完磁珠法,今天帶大家看一下同樣常用的TRIzol法核酸提取,適用于人類(lèi)、動(dòng)物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌,樣品量從幾十毫克至幾克,常用于從組織和細(xì)胞中分離和純化RNA,拒絕蛋白和DNA污染。


實(shí)驗(yàn)原理:

RNA質(zhì)量的高低常常影響cDNA庫(kù),RT-PCR和Northern Blot等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的成敗。Trizol是一種新型總RNA抽提試劑,內(nèi)含異硫氰酸胍等物質(zhì),能迅速破碎細(xì)胞,抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。TRIzol使樣品勻漿化,細(xì)胞裂解,溶解細(xì)胞內(nèi)含物,同時(shí)因含有RNase抑制劑可保持RNA的完整性。在加入氯仿離心后,溶液分為水相和有機(jī)相,RNA在水相中。取出水相用異丙醇沉淀可回收RNA;用乙醇沉淀中間層可回收DNA;用異丙醇沉淀有機(jī)相可回收蛋白質(zhì)。


實(shí)驗(yàn)步驟:

1、將組織在液氮中磨成粉末后,再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨,注意樣品總體積不能超過(guò)所用Trizol體積的10%。 

2、研磨液室溫放置5分鐘,然后以每1mlTrizol液加入0.2ml的比例加入氯仿,蓋緊離心管,用手劇烈搖蕩離心管15秒。 

3、取上層水相于一新的離心管,按每mlTrizol液加0.5ml異丙醇的比例加入異丙醇,室溫放置10分鐘,12000g離心10分鐘。 

4、棄去上清液,按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇,渦旋混勻,4℃下7500g離心5分鐘。 

5、小心棄去上清液,然后室溫或真空干燥5-10分鐘,注意不要干燥過(guò)分,否則會(huì)降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中,必要時(shí)可55℃-60℃水溶 10分鐘。RNA可進(jìn)行mRNA分離,或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。 

[注意] 1、整個(gè)操作要帶口罩及一次性手套,并盡可能在低溫下操作。 

          2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個(gè)月以上,RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周,-20℃保存一年。 

          3.由于樣本性質(zhì)和數(shù)量的區(qū)別,在樣本取樣后處理方式均有不同,紅榮微再有專(zhuān)業(yè)的技術(shù)崗位為您保駕護(hù)航,為您解決試劑使用過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題,保證實(shí)驗(yàn)成果。


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